常用的細(xì)胞染色方法有:
1、簡單染色法,常用堿性染料如美藍(lán)等進(jìn)行簡單染色;
2、革蘭氏染色法,主要包括結(jié)晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脫色以及番紅復(fù)染四個(gè)過程;
3、瑞氏染色法,瑞氏染料溶劑主要是由伊紅美藍(lán)組成;
4、吉姆薩染色法,吉姆薩染色原理與結(jié)果和瑞特染色法基本相同;
5、細(xì)胞免疫熒光染色法,免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合。
染色是生物顯微玻片標(biāo)本制作中最重要的環(huán)節(jié)之一。先把破壞細(xì)胞膜的選擇透過性,再使用染色劑,將生物組織浸入染色劑內(nèi),使組織細(xì)胞的某一部分染上與其他部分不同的顏色或深度不同的顏色,產(chǎn)生不同的折射率,以便觀察。
另外,銀染法也較常用。當(dāng)組織塊浸入硝xiao酸銀溶液中時(shí),有的組織結(jié)構(gòu)能直接把硝xiao酸銀還原,使銀粒附于其上,呈棕黑色或棕黃色。有些結(jié)構(gòu)本身對(duì)硝xiao酸銀無直接還原能力,若加入還原劑,可使硝xiao酸銀還原沉淀顯色。
細(xì)胞染色注意事項(xiàng):
1、細(xì)胞染色部位
細(xì)胞表面染色
胞內(nèi)抗原染色
同時(shí)標(biāo)記胞膜和胞內(nèi)抗原
單色標(biāo)記
多色標(biāo)記
2、細(xì)胞表面標(biāo)記
表面抗原也可能表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)
染色細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞一定是活的未標(biāo)記細(xì)胞
親細(xì)胞抗體的存在,使染色復(fù)雜??捎孟礈彀准?xì)胞的方法,或在不含離子的緩沖液中37C孵育1小時(shí),可有效去除親細(xì)胞抗體
Fc受體,可以加外源性免疫球蛋白阻斷或采用同型對(duì)照
3、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記
對(duì)細(xì)胞打孔,使單抗可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),同時(shí)又不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性
一般來說,進(jìn)行胞內(nèi)抗原染色時(shí)不能同時(shí)檢測細(xì)胞的活性,除非用EMA標(biāo)記
檢測某一抗原是否表達(dá),以及對(duì)抗原進(jìn)行表達(dá)定位時(shí),檢測同一標(biāo)本的胞膜和胞漿抗原要分開進(jìn)行。
對(duì)于某些核酸染料(如DAPI、TO、AO等)為活胞染料,無需固定或透膜
4、同時(shí)檢測胞膜和胞內(nèi)抗原
對(duì)表面標(biāo)志、胞內(nèi)抗原、DNA含量可任意組合同時(shí)分析 。
染色步驟是:細(xì)胞表面標(biāo)志--固定--細(xì)胞打孔--胞內(nèi)抗原--DNA含量 。
需要認(rèn)識(shí)到的是,用于固定和打孔試劑的多重影響,有些條件適合某一參數(shù)而對(duì)別的參數(shù)可能非常不合適。
每一步熒光染料的選擇與抗體的選擇一樣重要。對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記來說,一種熒光染料一定不能被隨后的打孔方法或試劑所影響。對(duì)胞內(nèi)抗原檢測來講,熒光素分子要足夠小,可以穿透打孔后的細(xì)胞。
5、單色標(biāo)記
間接標(biāo)記時(shí),可選擇單色標(biāo)記
6、多色標(biāo)記
考慮熒光信號(hào)之間的干擾。
細(xì)胞補(bǔ)償、微球補(bǔ)償
一些聯(lián)合使用的抗體會(huì)彼此阻礙與各自抗原的結(jié)合,比如通過空間位阻。因此,抗體組合使用前要與單色抗體標(biāo)記的結(jié)果做比較。