剛開(kāi)始做 Western blot 的同學(xué)們想必都大多都是研究生，雖然科研經(jīng)歷還不是特別豐富，但情感經(jīng)歷一定都比較豐富吧。
同學(xué)們想想自己剛談戀愛(ài)的時(shí)候，你剛喜歡一個(gè)人卻還沒(méi)表白之前，是不是每天都要想盡一切辦法了解他/她的愛(ài)好，他/她的習(xí)慣，他/她每天的路線等等，等你心里有數(shù)之后再開(kāi)始考慮如何表白？
做實(shí)驗(yàn)也一樣，在開(kāi)始 Western 之前，盡可能多的了解你的目的蛋白，這和談戀愛(ài)一樣，這樣表白成功的概率才會(huì)大大增加。
當(dāng)然，表白失敗也很正常，我們之前做的功課只是增加成功的概率而已，并不能減少失敗的概率，所以同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)時(shí)也不要過(guò)于有心里負(fù)擔(dān)，怕這怕那的，要保持一個(gè)自然的心態(tài)，否則容易抑郁。
今天我們就來(lái)看一看生物信息學(xué)的各種神器是如何來(lái)幫助我們的 Western blot 實(shí)驗(yàn)。大家在查找抗體的時(shí)候有沒(méi)有看見(jiàn)免疫原的序列和這兩個(gè)圖標(biāo)呢？
這個(gè)意思就是說(shuō)廠家在生產(chǎn)這個(gè)抗體的時(shí)候，先是合成了一段肽鏈，這個(gè)肽鏈的氨基酸序列是從蛋白質(zhì)序列里面摘錄的，下面 blast with 意思就是分別和 NCBI 的數(shù)據(jù)庫(kù)或 Expasy 的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)里的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。
這個(gè) blast 算法是比較復(fù)雜的，但對(duì)于我們醫(yī)學(xué)科研來(lái)說(shuō)，只需要知道 blast 就是一個(gè)序列比對(duì)的算法和工具就可以了。
前段時(shí)間有同學(xué)拿 α 腎上腺素能受體這個(gè)蛋白來(lái)問(wèn)我，想得到一些指導(dǎo)，那么我就從以下五個(gè)問(wèn)題來(lái)幫助他分析一下這個(gè)蛋白。
一：有沒(méi)有這個(gè)蛋白的抗體？
我們以 Abcam wang站為例，簡(jiǎn)單搜索一下，發(fā)現(xiàn)有很多相關(guān)的抗體，對(duì)于受體這樣豐都不高的蛋白質(zhì)，還是建議選擇單克隆抗體。
二：蛋白在什么組織中表達(dá)？
這個(gè)同學(xué)拿這個(gè)蛋白來(lái)問(wèn)我的時(shí)候說(shuō)，想研究大腦里的表達(dá)情況。如果你沒(méi)有太多時(shí)間去研究綜述的話，簡(jiǎn)單的辦法就是看 wiki 百科了。從 wiki 的介紹里可以看到，這個(gè)受體在神經(jīng)元里是能夠表達(dá)的，所以這個(gè)問(wèn)題就解決了。
三：蛋白在哪里？
這個(gè)從 wiki 百科句話我們就看到了，這是一個(gè) G 蛋白偶聯(lián)受體，肯定是一個(gè)跨膜蛋白無(wú)疑了，這也意味著這個(gè)蛋白不是那么容易做的。
四：如果是跨膜蛋白，跨幾次？
既然是跨膜蛋白，跨了幾次膜，有幾個(gè)壓基在胞外，有幾個(gè)亞基在胞內(nèi)？這時(shí)我們可以用 SOSUI 這個(gè)wang站來(lái)查詢。
五：蛋白的序列？分子量？PI？
我們先要從 NCBI 里查找一下這個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，我們以小鼠為例（mus musculus），如下圖所示：
然后我們把這個(gè)序列貼到 SOSUI 里面：
然后接得到這這些結(jié)果：
從這個(gè)結(jié)果我們知道這個(gè)蛋白跨膜 7 次，在胞內(nèi)有兩個(gè)較大的亞基，因此我們選擇裂解液至少也要用 RIPA 而不能用 NP40，否則不能把這個(gè)蛋白從細(xì)胞膜里面拽出來(lái)，或者需要用專(zhuān)門(mén)的膜蛋白提取試劑盒來(lái)操作。
選抗體的時(shí)候需要注意一下它的免疫原氨基酸序列是否是胞內(nèi)的氨基酸序列，因?yàn)檫@樣抗體識(shí)別的效果是jia的。
然后我們要計(jì)算一下 PI，可以用這個(gè)工具：
輸入氨基酸序列之后就得到了分子量和等電點(diǎn) PI：
這個(gè)信息對(duì)于我們選擇哪種轉(zhuǎn)膜緩沖液非常有幫助。
如果 PI 接近轉(zhuǎn)膜緩沖液的 pH 的話，蛋白質(zhì)電離程度小，帶的電荷就少，轉(zhuǎn)印效率就會(huì)非常低。
所以對(duì)這種蛋白質(zhì)，你選擇常規(guī)的 pH8.8 的轉(zhuǎn)膜緩沖液可能就不合適，至少應(yīng)該選 pH11 的 CAPS 轉(zhuǎn)膜緩沖液或者用 0.7% 乙酸的酸性轉(zhuǎn)膜液效果才會(huì)比較好。
否則不管你轉(zhuǎn)膜時(shí)間多長(zhǎng)，蛋白質(zhì)都在凝膠里一動(dòng)不動(dòng)，顯然實(shí)驗(yàn)室不會(huì)出結(jié)果的。如果你用酸性轉(zhuǎn)膜液的話，記得把膜放在凝膠的上面，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)是往負(fù)極移動(dòng)的。
轉(zhuǎn)載于丁香園
